O óxido nítrico (NO) é a menor molécula com atividade biológica conhecida até o momento. Sua meia-vida é de 1 – 5 segundos. É uma importante molécula mensageira, desempenhando um importante papel em muitos processos fisiológicos e patológicos. Ele regula uma variedade de funções dentro das células e tecidos, como vasodilatação, neurotransmissão e processos imunológicos.¹

A síntese de NO nos pulmões e nas vias respiratórias pode exercer diversas ações no desenvolvimento pulmonar, na regulação do tônus do músculo liso das vias aéreas, facilitando o fluxo de ar nos pulmões; na regulação do tônus do músculo liso dos vasos através de interação direta com o núcleo heme da guanilato ciclase solúvel (sGC), além de participar de processos inflamatórios e da defesa do hospedeiro.²

O NO atua como um neurotransmissor com ação relaxante sobre o músculo liso das vias aéreas, via nervos não adrenérgicos não colinérgicos (NANC). Verificou-se também que os relaxamentos iNANC dependentes de NO são devidos à ativação selectiva dos canais K_Ca no músculo no músculo liso das vias aéreas.³

O NO é produzido por uma grande variedade de células como as células epiteliais, as células nervosas, as células inflamatórias (neutrófilos, macrófagos, mastócitos) e as células endoteliais. Existem também várias funções homeostáticas atribuídas ao NO, incluindo efeitos antimicrobianos bactericidas e citotóxicos que desempenham papel na defesa do hospedeiro.⁴

O NO encontra-se presente normalmente no ar expirado do homem e de vários animais, estando significativamente aumentado no ar expirado de pacientes com asma (Figura 1),^5,6 constituindo-se em uma forma não invasiva de avaliar a inflamação Tipo 2 (T2)-alta na asma.^7-10

A fração exalada do óxido nítrico (FeNO) se encontra aumentada na asma atópica, aumenta durante as exacerbações, diminui com o tratamento com corticoide inalatório (CI)^11-13 e se eleva quando as doses de CIs são reduzidas (Figura 2).¹⁴ Os níveis de FeNO correlacionam-se com o número de eosinófilos no escarro induzido,^5,6,15 com os níveis de proteína catiônica eosinofílica (ECP), com a proteína X eosinofílica (EPX) urinária, com a hiper-responsividade brônquica à adenosina-5'-monofosfato (AMP)¹⁶ e com o exercício.

A FeNO tem sido preconizada como uma prova de função pulmonar e recomendada como forma de monitorar o grau de inflamação das vias aéreas na asma, existindo evidências de que seja o primeiro 'marcador' a aumentar durante o agravamento da doença. Entretanto, como instrumento de diagnóstico a FeNO deve ser utilizada em conjunto com os métodos habituais disponíveis.¹⁷

O NO é um gás livremente difusível, formado a partir do aminoácido semiessencial L-arginina (desaminação), quando de sua transformação em L-citrulina, reação mediada pela enzima sintase do óxido nítrico (NOS).

A NOS catalisa uma oxidação de cinco elétrons de um nitrogênio amidina da L-arginina. N-hidroxi-L-arginina é um intermediário que permanece firmemente ligado à enzima. Os produtos finais desta reação enzimática são em quantidades equimolares, o NO e a L-citrulina, formados através de monoxidação com Nw–hidroxiarginina que  é um intermediário que permanece ligado firmemente à enzima. Este processo requer oxigênio como um cosubstrato e NADPH como fonte de elétrons. A NOS consiste em uma enzima muito complexa, empregando cinco cofatores redox: NADPH, FAD (flavina adenina dinucleotídeo), FMN (flavina mononucleotídeo), heme e tetraidrobiopterina (BH4) (Figuras 3,4).^18-20 O NO tem uma meia-vida muito curta nos tecidos (1-5 segundos), pois reage com o oxigênio e superóxido. O NO é um gás altamente lábil, não estocável, difunde-se com facilidade do local de formação até o sítio de ação pois é solúvel tanto na água como em lipídios, difundindo-se livremente nos tecidos. Apresenta uma ação típica de segundo mensageiro para células-alvo, onde ativa o sistema guanilciclase, com o aumento da produção de guanidina monofosfato cíclico (GMPc), através do qual determina vários efeitos biológicos (neurotransmissão, vasodilatação, broncodilatação, ...).²¹

Pelo menos três tipos de isômeros da NOS estão identificados.²² Dentre as isoformas chamadas constitutiva (cNOS) temos a encontrada na célula neuronal (tipo I ou nNOS); a indutível NOS (tipo II ou iNOS) e a constitutiva endotelial NOS (NOS III ou eNOS).

A atividade intracelular das isoformas constitutivamente expressas é regulada pela disponibilidade do substrato L-arginina, que é determinada pela captação celular,²³ pela competição com outras enzimas que metabolizam a L-arginina, em particular as isoenzimas arginases (arginase I e II),²⁴ pela presença de inibidores endógenos da NOS, incluindo a dimetilarginina assimétrica (ADMA) e simétrica (SDMA) e a monometilarginina (MMA),²⁵ e por reciclagem da L-citrulina/L-arginina.²⁶

A iNOS (expressão inibida pelo corticoide) ou tipo II tem sua produção estimulada e aumentada na inflamação, por citocinas e outros mediadores de várias células, incluindo macrófagos, linfócitos, fibroblastos, células epiteliais, e musculares lisas das vias aéreas. Os eosinófilos desempenham um papel importante na ativação da expressão de iNOS ao secretarem IL-13, uma citocina que promove o aumento da expressão de iNOS nas células epiteliais. Esse processo leva a uma elevação nos níveis de NO e FeNO. As nNOS, iNOS e eNOS são produtos de genes distintos, localizados em diferentes cromossomos humanos (cromossomos 12, 17 e 7 respectivamente), cada um com certas características e expressão tecidual específica. Dentre as citocinas, aumentam a expressão da NOS in vitro, o TNF-α, IFN-γ e a IL-1β.²⁷

As cNOS e iNOS podem ser obtidas através de cultura de células epiteliais respiratórias^28-30 embora a expressão iNOS predomine in vivo. Biópsias transbrônquicas obtidas em asmáticos, utilizando coloração imuno-histoquímica, demonstram aumento da atividade iNOS, quando comparadas com não asmáticos.³¹

Quanto ao seu metabolismo o NO após a sua formação se decompõe em outros óxidos de nitrogênio, chamados nitrito (NO₂^-), produto da reação do NO com oxigênio molecular (O₂) em fase aquosa e trióxido de dinitrogênio (N₂O₃). Também reage com superóxido para peroxinitrito (ONOO^-). O peroxinitrito está em equilíbrio com o ácido peroxinitroso (ONOOH), formados a partir da reação com o radical superóxido (O₂^-). Estes óxidos de nitrogênio também reagem com uma variedade de outras moléculas para formar numerosos produtos biologicamente ativos. A magnitude destas modificações se correlaciona com o grau de estresse oxidativo e nitrosativo.

Estudos sugerem que a asma possa ser uma condição de biodisponibilidade reduzida de NO,^32,33 ao invés de uma superprodução como resultado de inflamação.^34,35 As células epiteliais de pacientes com asma expressam reduzida concentração de L-arginina para níveis aumentados da iNOS e pode conduzir à geração de peroxinitritos e radicais hidroxila, contribuindo para o aumento da contratilidade do músculo liso brônquico, inflamação das vias aéreas, com consequente dano tecidual. O desequilíbrio no metabolismo da L-arginina, que leva à constrição das vias aéreas, pode ocorrer também através do aumento da atividade da arginase ou da acumulação de inibidores endógenos da NOS, como a dimetilarginina assimétrica (ADMA).³⁶

A inibição da NOS pela ADMA leva ao desacoplamento, produzindo superóxido e peroxinitrito. Esses mecanismos ocorrem em múltiplos fenótipos de asma, incluindo a inflamação induzida por T2. No entanto, alterações no metabolismo da arginina na asma relacionada com a obesidade parecem ter um papel importante nesse contexto.^36,37

Em pacientes com asma, o NO em níveis elevados (particularmente o produzido pela iNOS) pode contribuir para a hiper-responsividade brônquica (HRB), cuja característica é a exagerada resposta das vias aéreas a estímulos como alérgenos ou irritantes. Por outro lado, o excesso de NO também pode levar à formação de espécies reativas de nitrogênio, como o peroxinitrito, que causam danos teciduais e aumentam a responsividade das vias aéreas. Nas formas severas da asma existe possível participação no remodelamento das vias aéreas. Estímulos pró-inflamatórios e citocinas também ativam a expressão da iNOS no epitélio, elevando os níveis de óxido nítrico. Esse aumento promove respostas inflamatórias crônicas e a nitração de proteínas relacionadas à proliferação, apoptose e migração celular, resultando em lesão do tecido epitelial.

Uma teoria sobre a asma relaciona a L-arginina, a arginase e o NO endógeno (Figura 5).³⁸ Além da arginina atuar como substrato para a NOS, que gera NO, um regulador essencial da fisiologia das vias aéreas. A arginase I e a arginase II controlam a conversão da arginina em ornitina, que posteriormente é utilizada na formação de prolina e poliaminas. Esses produtos exercem múltiplos efeitos sobre o tecido conjuntivo, a musculatura lisa e a síntese de muco. As vias da NOS e da arginase competem entre si pelo mesmo substrato, interferindo uma na outra. As citocinas TH2 induzem à expressão da arginase, e durante a inflamação alérgica, o aumento da IL-4 e/ou IL-13 promove a expressão aumentada de arginase, intensificando a via dependente desta enzima e suprimindo a produção de NO. Esse processo resulta em hiper-responsividade das vias aéreas, aumento da produção de muco e colágeno, contribuindo para a patogênese da asma. A arginase I e a arginase II controlam a transformação da L-arginina em L-ornitina, que por sua vez dá origem à L-prolina e poliaminas.^39,40

A arginase I é uma proteína citoplasmática que participa do ciclo da biossíntese da ureia, sendo expressa primariamente em grande quantidade no fígado. A arginase II é uma proteína mitocondrial expressa em vários tecidos, principalmente na próstata e nos rins.⁴¹ A exata função da arginina extra-hepática agora é que começa a ser melhor esclarecida. Entretanto, o aumento de sua expressão é capaz de aumentar a síntese da prolina e/ou poliaminas, que são necessárias para o crescimento e divisão celular. Isso é relevante em processos de cicatrização e regeneração tecidual. A sua expressão aumenta a síntese da putrescina, espermidina e espermina, essenciais no metabolismo que controla a produção e proliferação de colágeno, com efeitos no tecido conjuntivo e a proliferação de músculo liso vascular,⁴² de células endoteliais⁴³ e síntese de muco.^39,40 As arginases I e II são expressas constitutivamente nas vias aéreas, particularmente no epitélio brônquico e nos fibroblastos.^33,44,45

Morris et al.⁴⁶ avaliaram em um grupo de pacientes com asma os níveis de arginase e da L-arginina plasmáticos. Quando comparados ao grupo controle, os pacientes com asma exibiram uma redução notável nos níveis plasmáticos da L-arginina em comparação com indivíduos normais sem asma (45 ± 22 versus 94 ± 29 µM, p< 0,0001), enquanto que a atividade sérica da arginase estava elevada (1,6 ± 0,8 versus 0,5 ± 0,3 µmol/ml/hora, asma v. controle, p< 0,0001) (Figura 6). A alta atividade da arginase em asmáticos pode contribuir para baixos níveis circulantes de L-arginina, limitando a biodisponibilidade da L-arginina e criando uma deficiência de NO o que induz a vias aéreas hiper-responsivas. A atividade sérica aumentada da arginase também foi quantitativamente relacionada à limitação do fluxo aéreo, medida pelo VEF₁.^46,47

As células epiteliais de pacientes com asma expressam reduzida concentração de L-arginina para níveis aumentados da iNOS e pode conduzir à geração de peroxinitritos e radicais hidroxila, contribuindo para o aumento da contratilidade do músculo liso brônquico, inflamação das vias aéreas, com consequente dano tecidual.

Na resposta asmática tardia o aumento da atividade das arginases pelas citocinas TH2 (IL-4, IL-13) e pelo TGF-ß nas vias aéreas determina uma reduzida disponibilidade de L-arginina para aumento da expressão da iNOS. E a mesma pode começar a gerar ânion superóxido (O_^2-), causando uma deficiência de NO,⁴⁸ ampliando o consumo de NO, pelo aumento da formação de peroxinitrito (ONOO^-), podendo determinar dano pulmonar^48,49 o que pode estar relacionado à obstrução das vias aéreas provocada por alérgenos, à inflamação e hiper-responsividade e à maior sensibilidade aos alérgenos. Além disso, a atividade aumentada da arginase eleva a produção de L-ornitina e seus produtos de síntese, poliaminas e L-prolina, as quais podem ter participação no remodelamento das vias aéreas, através da proliferação celular, intensificando a produção do colágeno e da fibrose, respectivamente (Figura 7).⁵⁰

Através da hibridização in situ para a arginase I mRNA, Zimmermann et al.⁵¹ detectaram pela técnica antissense em pulmões de um modelo experimental de asma, altos níveis de arginase I em áreas de inflamação peribrônquica e perivascular. No entanto, em camundongos do grupo controle, não houve expressão detectável da enzima.

Na mesma publicação⁵¹ os autores apresentam um estudo efetuado em humanos, quando analisaram a expressão da proteína L-arginase I, no lavado broncoalveolar (Figura 8), em pacientes com asma e em um grupo controle. Obtiveram por imuno-histoquímica um número significativo de células que expressavam a arginase I no grupo com asma, principalmente em macrófagos e células mononucleares. A hibridização in situ em biópsias brônquicas destes pacientes detectou intensa  concentração de células arginase I mRNA, tendo sido indetectável no grupo controle.

Em um modelo de asma utilizando porquinhos-da-índia, Maarsingh et al.⁵² empregando um potente inibidor específico da arginase por inalação, o ácido 2(S)-amino-6-boronohexanoic (ABH), obtiveram considerável redução da reação asmática precoce e tardia, presumivelmente atenuando a deficiência de substrato induzida por arginase para NOS nas vias aéreas após provocação com alérgeno. Além disso o ABH reduziu a hiper-responsividade brônquica e a inflamação, indicando o potencial que os inibidores das arginases podem apresentar como tratamento na asma alérgica.⁵²

O NO atua como broncodilatador ao agir como um neurotransmissor da parcela broncodilatadora do sistema NANC, em oposição aos estímulos colinérgicos broncoconstritores, bem como inibindo a inflamação das vias aéreas e a liberação de mediadores pelos mastócitos. A fim de investigar o papel do NO na inflamação, testes de provocação antigênica têm sido utilizados. A provocação antigênica frequentemente determina em asmáticos respostas precoce, tardia ou ambas, que são demonstradas por queda no VEF₁ e elevação tardia na FeNO.⁵³ Pacientes que apresentam resposta precoce ou precoce e tardia quando inalam previamente ao teste de broncoprovocação um potente inibidor de todas as NOS o NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) não apresentam mudanças nos valores basais do VEF₁ deixando, entretanto, de eliminar NO.⁵⁴ Além disso, asmáticos com asma leve que não recebem corticoides, quando se submetem à nebulização com L-NAME e aminoguanidina (um inibidor seletivo da iNOS), demonstram redução na FeNO, embora nenhuma mudança nos sintomas ou no VEF₁ seja detectada.⁵⁵ Estes estudos nos levam a concluir que o NO endógeno não atua de forma expressiva na broncodilatação do paciente asmático. 

Por outro lado, o NO apresenta efeitos supressivos nos linfócitos TH1, proporcionando possível proliferação de linfócitos TH2 e aumento da produção de IL-4 e IL-5 e consequente inflamação eosinofílica. O NO é capaz de interagir com o ânion superóxido produzindo radicais altamente tóxicos de peroxinitritos (ONOO^-) que podem contribuir para dano tecidual na asma. O NO bloqueia a apoptose dos eosinófilos mediada via receptor Fas, sugerindo ação pró-inflamatória.⁵⁶

O NO é um potente vasodilatador na circulação brônquica e pode determinar o extravasamento de plasma pelo aumento do fluxo sanguíneo nas vênulas pós-capilares afetadas, determinando aumento da resistência das vias aéreas pela exsudação.

O NO também é produzido como mediador local por macrófagos e neutrófilos ativados, a fim de auxiliar na destruição de microrganismos invasores. Demonstrou-se uma ação antiviral do NO em células de murídeos e in vivo em ratos. Sanders et al.⁵⁷ demonstraram pela primeira vez que o NO pode inibir a replicação do rinovírus e a produção de citocinas por ele induzidas.⁵⁸ Na Figura 9 são apresentados os efeitos do NO nos pulmões.

O NO é um radical livre gasoso, com uma meia-vida extremamente curta, de alguns segundos, rapidamente destruído pela interação como o oxigênio. Na asma o NO é o teste de respiração exalada bastante utilizado na prática clínica. Trata-se de um teste útil, prático, confortável, sensível, reprodutível, não invasivo, que apresenta forte correlação com a inflamação das vias aéreas. A fonte de FeNO vem da ação de várias enzimas NOS diferentes, mas a principal fonte dos níveis aumentados de NO identificados na asma vem da enzima iNOS (NOS2 induzível) que é induzida no epitélio das vias aéreas pela inflamação.^60-62

As técnicas e os valores de referência para todas as idades para a medida do NO exalado foram estandardizadas pela European Respiratory Society (ERS) e pela American Thoracic Society (ATS) em 2005.⁶³ Em 2011 a ATS publicou um Guideline oficial sobre a interpretação e aplicações clínicas da FeNO.⁶⁴

Na atualidade os dispositivos para medir a FeNO empregam tecnologia mais moderna que utiliza leitura através de sensor eletroquímico que torna as leituras equivalentes àquelas obtidas com quimioluminescência. Ao contrário da geração anterior os novos aparelhos são mais compactos, portáteis, fáceis de manusear e de manter, mais rápidos e baratos.⁶⁵ (Figura 10)

A técnica tradicional, utilizava a análise por quimiluminescência baseada na medida da intensidade da radiação fluorescente emitida após oxidação química do NO pelo ozônio – NO  +  O₃ –, utilizando um tubo fotomultiplicador sensível. O produto desta reação é o NO₂* +  O₂   (onde * simboliza a luz emitida). O NO₂* emite um fóton e o número total de fótons produzidos é proporcional à concentração de NO.⁶⁶

O teste pelo método de respiração única: (técnica tradicional)

I. Na posição sentada o paciente esvazia os pulmões;

II. Através da peça bucal o paciente inala ar isento de NO, em 2 – 3 segundos, eliminando a possibilidade de qualquer contaminação através do ar ambiente, até o nível da CPT;

III. Sem interrupção, passa então a exalar lentamente através da peça bucal, durante 10 segundos, mantendo o fluxo expiratório constante de 0,05 l .segundo ^-1 (BTPS) através de uma válvula mecânica contendo uma membrana elástica, quando ao final efetua-se a leitura. Uma pressão de 5-20 cm H₂O é gerada durante a exalação, o que fecha o palato, propiciando a exclusão nasal.

IV. O valor daFeNO é calculado pela criação de um platô por no mínimo 3 segundos. Como a exalação ocorre em 10 segundos, o platô situa-se entre 70 a 100% da exalação (entre 7 – 10 segundos) (Figura 11).

Em não fumantes, a fração exalada normal de NO (FeNO₅₀) é < 25 partes por bilhão (ppb) para adultos a 50 ml/seg e em crianças < 20 ppb. Valores maiores que 50 ppb (35 ppb em crianças) são altamente preditivos de inflamação TH2 eosinofílica de vias aéreas e de provável resposta positiva ao tratamento com corticoide por inalação (Tabela 1).

À medida que os níveis de FeNO aumentam, a especificidade para indicar a necessidade de intensificar o tratamento também cresce. Por outro lado, a aceitação de valores mais baixos de FeNO para guiar decisões terapêuticas prioriza a sensibilidade, visando detectar precocemente situações em que o ajuste da terapêutica possa melhorar o controle da asma.¹⁷

As medidas da FeNO podem ser efetuadas em quase todos os adultos e crianças acima de cinco anos. Níveis menores de FeNO de 30–60%, dependendo do consumo diário, são encontrados em fumantes. Infecções respiratórias elevam a FeNO, como no caso do Rinovírus, que pode oscilar de 50–150%, quando se deve repetir o exame dentro de 14 dias.⁶⁷

Evolutivamente, reduções na FeNO (< 25 ppb em adultos; < 20 em crianças abaixo de 12 anos) podem ter um papel na identificação de pacientes em que se pode reduzir com segurança as doses de corticoide.

A medida da FeNO deve sempre ser efetuada antes da espirometria ou de qualquer atividade física e os examinados devem abster-se, por uma hora, de fumar ou ingerir alimentos ou líquidos. As infecções virais,⁶⁸ a rinite alérgica⁶⁹ e dieta rica em nitrato⁷⁰ podem influenciar os resultados, elevando-os. O tabagismo reduz os valores da FeNO. Fumantes "saudáveis" normalmente têm níveis de FeNO entre 2-10 ppb.⁷¹ Quando os resultados são elevados, pode significar inflamação eosinofílica, merecendo investigação criteriosa, principalmente se houver história de asma em algum período da vida. A sensibilidade do teste FeNO é alta em pacientes não tratados.⁷²

Embora a FeNO elevada seja classicamente considerada um marcador de asma mal controlada nas pessoas com inflamação provocada por T2, está bem documentado que as pessoas com asma de início tardio relacionada com a obesidade têm maior probabilidade de apresentar níveis mais baixos de FeNO.⁷³

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